大家好，本周为大家带来一篇发表在AnalyticalChemistry上的文章，StrongAcidAnionsSignificantlyIncreasingtheChargeStateofProteinsduringElectrosprayIonization[1]，本文的通讯作者是来自中国计量科学研究院的龚晓云、戴新华研究员。
在电喷雾离子化（ESI）过程中，提高蛋白的电荷价态（supercharging）会使其质荷比降低，扩大质谱能检测的质量范围，提高分辨率，也会使蛋白更易解离，提高“自上而下”（Top-down）蛋白质组学研究中蛋白质的序列覆盖率，且对于基于电子的碎裂方式（如ECD、ETD等），高价态离子的捕获电子效率和解离效率都更高。早期的提高蛋白电荷价态的研究主要基于变性的方法，如在溶液中使用强酸、强碱、高温变性。也可以在ESI界面处使用引入了酸性或碱性蒸汽的逆吹干燥氮气来实现蛋白质的解折叠，这样蛋白样品在进入ESI前仍是native状态。
不同溶剂对蛋白带电状态的影响不同，常见的superchargingagent（SCA）有3-硝基苯甲醇（m-NBA），环丁砜，环烷基碳酸盐，二甲基亚砜（DMSO）等。SCA的作用原理仍有争议，目前可分为native和denatured两种，前者被认为基于电荷残留模型（chargedresiduemodel，CRM），即SCA包裹在带电液滴外面阻止样品离子从溶剂中喷出，更多的正电荷会留在液滴里面并最终与样品分子结合，后者经历链发射模型（chainejectionmodel，CEM），即样品在溶液中解折叠，SCA通过其高极性与低挥发性，促进H+与样品分子结合并稳定结合位点。此外，电热效应也可被用来提高蛋白电荷价态（electrothermalsupercharging，ETS），方法是向样品溶液中加入碳酸氢铵（或磷酸一氢铵）等盐，再加更高的喷雾电压，ETS的有效性与阴离子的种类有关。
该课题组前期的实验中，利用极性反转nano-ESI技术检测了强酸盐对样品supercharging的影响，证明了强酸盐中阴离子的类型起到关键作用。在本文中，他们发现在酸性条件下，所加入的阴离子的共轭酸酸性越强，对提高蛋白价态的作用就越明显，如Cl-、Br-、I-、NO3-、TFA-；而弱酸对应的阴离子对提高蛋白价态几乎没有作用，如Ac-、FA-、HS-；不同阳离子对阴离子发挥作用的影响差异不大。作者认为，强酸阴离子的作用源于对蛋白质结构的解折叠，弱酸阴离子的水解作用是导致其与强酸阴离子产生差异的关键因素。
一、盐的影响
作者依次考察了NaCl、钠盐、氯盐对supercharging的影响，结果分别如图1、2、3所示，并按照图1中公式（1）计算了强度加权平均电荷状态（intensity-weightedaveragechargestate，qav），公式中qi为第i个电荷状态的净电荷，Wi为第i个电荷状态的信号强度，N为谱图中蛋白电荷状态的总数。样品为Cytc（10μM）+1%HAc，因1%HAc无法使Cytc完全变性，图1a中Cytc表现为两个电荷态分布，非变性（9+）蛋白占主要成分，qav为10.9+。在1mMNaCl加入后，qav提高到了15.1+。NaCl浓度提高到5mM导致Cytc更高的价态，qav提高到了15.4+，但再增加NaCl浓度到9mM与12mM后价态反而下降，故最终选用5mM为最佳钠盐浓度（下同）。
图1NaCl对提高Cytc价态的影响结果，样品为Cytc（10μM）+1%HAc
同理，图2是四种钠盐对提高Cytc价态的作用结果，均使用强酸的酸根离子（Br-、I-、NO3-、TFA-），将qav与图1a比较可知所有种类的阴离子都有显著提高蛋白价态的作用，只是影响程度不同，Br-、I-高于Cl-，NO3-、TFA-低于Cl-，在使用NaTFA时，谱图主要呈现NaTFA簇，但也能分辨出Cytc的双价态分布。
图2四种钠盐对提高Cytc价态的影响结果，样品为Cytc（10μM）+1%HAc
接着，作者考察了两种弱酸阴离子HS-和Ac-（如图3），发现谱图被NaHS和NaAc的峰干扰，Cytc电荷态与初始图谱（图1a）差异不大，甚至qav有所降低，证明酸根阴离子的supercharging能力与酸性强弱有关。作者还考察了不同阳离子的其他八种氯盐，且包括了不同价态的阳离子，控制加入的氯离子浓度均为5mM，结果显示在阴离子同为Cl-的情况下，所有氯盐均可提高电荷价态，氯盐之间差异不显著，且与阳离子共轭碱的强度无关。
图3两种弱酸阴离子对Cytc价态的影响结果，样品为Cytc（10μM）+1%HAc
二、酸的影响
作者发现，样品溶液中一定量的酸的存在对阴离子发挥作用至关重要，且较高浓度的酸会增强阴离子对提高价态的作用（图4）。当未向样品中添加酸、只添加强酸阴离子时，几乎没有观察到价态增加，HAc的加入可以恢复Cl-的作用，当HAc浓度提高到0.1%与1%时恢复作用更为显著，由Holo-Mb逐渐变为Apo-Mb的现象可用酸破坏四级结构来解释。
图4加入不同浓度的HAc时Holo-Mb的价态分布，样品为Holo-Mb（10μM）
三、机理解释
当Cytc用甲醇-水-醋酸（50:49:1）溶解后，价态呈单一的高价态分布，qav为15.7+，此时蛋白变性完全，此结果与5mMNaCl导致的结果相似，若50%甲醇和5mMNaCl同时加入Cytc中，蛋白的价态也不会进一步提高，证明强酸阴离子在酸性条件下提高电荷价态的机理是将蛋白质解折叠。
作者用圆二色光谱检测了不同条件下蛋白的二级结构变化（图5），图中和nm处的两个峰提示结构中的两个α-螺旋，黑色谱线代表native状态蛋白，结果表明在非酸性体系中，增加NaCl浓度不会破坏蛋白二级结构（图5a），0.01%HAc存在下50mM的NaCl足以改变二级结构（图5b）。对于弱酸阴离子Ac-，无论酸存在与否都不易使蛋白变性，也解释了弱酸阴离子supercharging能力不如强酸阴离子的现象。（图5c和d中-nm处部分谱线未展示是因为被NaAc的吸收峰干扰）
图5不同条件下Holo-Mb的CD谱图，样品为Holo-Mb（10μM）
最后作者比较了相同pH下一氯乙酸（monochloroaceticacid，MCA）、HCl、HAc对Cytc电荷价态的影响（图1a、图6），三者的酸性强度为HClMCAHAc，尽管初始pH均与1%HAc的pH值相同（pH=2.74），三种酸对蛋白价态的影响具有显著的区别：HAc的supercharging能力最弱，HCl最强。可能的原理是在ESI喷雾过程中，样品液滴越来越小，pH值也越来越低，AC-离子的水解作用增强，导致实际发挥作用的阴离子数量减少。
图6MCA、HCl对Cytc电荷价态的影响，样品为Cytc（10μM）综上所述，作者研究了不同阴离子对蛋白带电状态的影响，强酸阴离子在酸性条件下可显著提高蛋白价态，机理为蛋白质解折叠；弱酸阴离子不能显著提高蛋白价态，因在ESI的去溶剂化过程中，喷雾液滴的pH值降低，加剧了弱酸阴离子的水解，使其浓度降低，减少了弱酸阴离子对蛋白质结构的影响；阳离子的种类对蛋白价态没有显著影响。该工作提示我们，在调节蛋白质电荷状态时应考虑到酸性溶液中强酸盐对蛋白质的影响。
撰稿人：英语佳
编辑：李惠琳
文章引用：FengL,GongX,SongJ,etal.StrongAcidAnionsSignificantlyIncreasingtheChargeStateofProteinsduringElectrosprayIonization.AnalChem,.
参考文献
[1]FengL,GongX,SongJ,etal.StrongAcidAnionsSignificantlyIncreasingtheChargeStateofProteinsduringElectrosprayIonization.AnalChem,.
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